Las vesículas extracelulares (EVs) proporcionan una herramienta valiosa para analizar procesos fisiológicos porque transportan, en fluidos biológicos, biomoléculas secretadas de diversos tejidos de un individuo. La detección de biomarcadores EVs requiere técnicas altamente sensibles capaces de identificar moléculas individuales. En el presente estudio, evaluamos los parámetros críticos para optimizar un ensayo basado en inmunocaptura de EVs seguido de citometría de flujo para el análisis de EVs en muestras biológicas. Adicionalmente, describimos un método sencillo para la detección de EV utilizando marcadores EV generales como las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81, que permiten la detección altamente sensible de EV de orina sin enriquecimiento previo. En experimentos de prueba de concepto, se identificó un marcador epitelial enriquecido en células de carcinoma, EpCAM, en EVs de líneas celulares y directamente en muestras de orina. Este método tiene el potencial de permitir que cualquier laboratorio con acceso a la citometría de flujo convencional identifique marcadores de superficie en EVs, incluso proteínas no abundantes, utilizando muestras biológicas mínimamente procesadas.